綠色熒光蛋白激發(fā)觀察方法

隨著時(shí)代科技發(fā)展進(jìn)步，觀察熒光蛋白的技術(shù)也越來越便捷，傳統(tǒng)的熒光顯微鏡觀測熒光蛋白有很多局限性，2021年美國路陽生產(chǎn)的便攜式熒光蛋白激發(fā)觀測燈給轉(zhuǎn)基因研究工作者帶來了便捷性，無需取樣，打開觀測燈直接照射熒光蛋白，肉眼就能清晰看到熒光蛋白在葉片、愈傷、種子、菌落等載體上的表達(dá)。無論是綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白或紅色熒光蛋白，一臺觀測燈就能直接觀測2種熒光蛋白的表達(dá)?，F(xiàn)上海峰志儀器有限公司技術(shù)工程師針對綠色熒光蛋白的觀測原理、幾種觀測方法介紹如下：

綠色熒光蛋白(GFP)：

綠色熒光蛋白(GFP)，是一個(gè)由約238個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，從藍(lán)光到紫外線都能使其激發(fā)，發(fā)出綠色螢光，在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)中，綠色螢光蛋白(GFP)基因常用做報(bào)告基因。綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動(dòng)物(例如:兔子)上進(jìn)行表現(xiàn)，并拿來映證某種假設(shè)的實(shí)驗(yàn)方法。通過基因工程技術(shù)，綠色螢光蛋白(GFP)基因能轉(zhuǎn)進(jìn)不同物種的基因組，在后代中持續(xù)表達(dá)。現(xiàn)在，綠色螢光蛋白(GFP)基因已被導(dǎo)入并表達(dá)在許多物種，包括細(xì)菌，酵母和其他真菌，魚（例如斑馬魚），植物，蒼蠅，甚至人等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。

GFP吸收的光譜峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對細(xì)胞的傷害小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長下穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。

由于熒光蛋白能穩(wěn)定在后代遺傳，并且能根據(jù)啟動(dòng)子特異性地表達(dá)，在需要定量或其他實(shí)驗(yàn)中慢慢取代了傳統(tǒng)的化學(xué)染料。更多地，熒光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解決問題的新思路，也可能帶來更多有價(jià)值的新問題。

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上圖：熒光蛋白激發(fā)觀測燈照射植物根系，GFP熒光蛋白在根系上的表達(dá)

綠色熒光蛋白的激發(fā)觀察方法

1. 紫外光源
采用LUYOR-3410UV便攜式紫外光源（又叫高強(qiáng)度紫外線燈、黑光燈）觀察也非常方便，但如果觀察植物，植物葉片的葉綠色在紫外線燈下也會(huì)發(fā)出熒光，對gfp發(fā)出的熒光也會(huì)產(chǎn)生干擾，另外，標(biāo)本長時(shí)間在紫外光源照射下對GFP標(biāo)本組織也會(huì)造成破壞。

2. 便攜式GFP激發(fā)光源
采用LUYOR-3415RG便攜式GFP激發(fā)光源(又叫熒光蛋白觀測鏡、熒光蛋白激發(fā)觀測燈）是便捷、方便的觀察方法，因GFP在470nm有一個(gè)很高的吸收峰，采用 470nm激發(fā)光源能夠激發(fā)GFP發(fā)出明亮的綠色熒光，在觀察gfp熒光時(shí)，因?yàn)榧ぐl(fā)光為強(qiáng)烈的藍(lán)色光線，佩戴專業(yè)的觀察眼鏡才能觀察到清晰的熒光信號。

上圖：熒光蛋白激發(fā)觀測燈照射斑馬魚，紅色熒光蛋白在斑馬魚上的表達(dá)

3、熒光顯微鏡
熒光顯微鏡： 熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用熒光顯微鏡觀察，熒光顯微鏡在實(shí)驗(yàn)室普及。
但熒光顯微鏡zui大的缺點(diǎn)是需要取樣才能觀察，如果樣本過大，無法放置在熒光顯微鏡上面，需要破壞樣本進(jìn)行取樣。 觀察植物葉片需要摘取葉片才能觀察。有時(shí)候觀察組培苗，組培苗在組培瓶里面無法取出，就無法在熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡在觀察熒光時(shí)候還是有很多的局限性。

總之，如果要激發(fā)熒光蛋白的熒光，觀測熒光蛋白的表達(dá)效果，LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)觀測燈是相對理想的觀測工具，上海峰志儀器有限公司銷售的LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)觀測燈檢測轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白（GFP）基因、紅色熒光蛋白（DsRed）；檢測基因植物：水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、擬南芥；檢測轉(zhuǎn)GFP、DsRed基因動(dòng)物：小鼠、兔子、猴子等；檢測轉(zhuǎn)GFP、DsRed基因微生物：細(xì)菌、真菌、酵母等檢測GFP、DsRed基因組織特異性表達(dá)。上海峰 志儀器為美國路陽授權(quán)代理商，現(xiàn)貨供應(yīng)美國路陽的LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)觀測燈。

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